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抗體及其使用的基本知識

時間:2017-12-13 22:19:16 瀏覽:

第一章:抗體和抗體的結構

 

抗體,也叫免疫球蛋白 (Ig),是一種能特異性結合抗原的糖蛋白,而抗原是在易感染動物體內引發抗體產生的物質。在體內,抗體是由于外源性分子的侵襲而產生的??固逡砸桓齷蛘叨喔?/span> Y 字形單體存在,每個 Y 字形單體由 4 條多肽鏈組成,包含兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。輕鏈和重鏈是根據它們的分子量大小來命名的。Y 字形結構的頂端是可變區,為抗原結合部位。 任何一個抗體的輕鏈都可以分為κλ型(基于小分子多肽結構上的差異),每一個抗體的重鏈則決定了它的類或型。

 

重鏈  

 

哺乳動物 Ig 的重鏈一共有五種,分別用希臘字母α、δ、ε、γ μ 來命名,相對應組成的抗體就稱為 IgA、IgD、IgE、IgG IgM 五種抗體。不同的重鏈在大小和組成上有所區別,αγ包含大約 450 個氨基酸,而 μ ε則有大約 550 個氨基酸。

 

每個重鏈有兩個區:恒定區和可變區。所有同一型的抗體其恒定區都是相同的,不同型的抗體之間則存在差異。重鏈γ、αδ的恒定區的 組成為 3 個前后串聯的 Ig 結構域,并有一個鉸鏈區增加它的靈活性;重鏈 μ ε的恒定區則由 4 Ig 結構域組成。不同 B 細胞產生的抗體 其重鏈的可變區不同,但同一種 B 細胞或細胞克隆產生的抗體其可變區則是相同的,每一個重鏈的可變區都是大約 110 個氨基酸長度,并組成一個單獨的Ig 結構域。

 

輕鏈

 

哺乳動物只有兩種輕鏈:λ型和κ型,每條輕鏈有兩個前后相連的結構域:一個恒定區和一個可變區。輕鏈的長度大約為 211~217 個氨基酸,每個抗體包含的兩條輕鏈總是相同的,對哺乳動物來說每一個抗體中的輕鏈只有一個型:κλ型。在一些低等的脊椎動物中,像軟骨魚類(軟骨魚)和硬骨魚類體內也會發現其他型的輕鏈如ι(iota) 型。




根據Y形結構的數量和重鏈種類的不同,哺乳動物體內的抗體可以分為 5 類:IgG、IgM、IgA、IgD、IgE,它們的重鏈分別是γ、μ、α、 δ、ε。各類抗體在生物學特性、功能區域以及結合不同抗原的能力上有所不同,如下表所列:

 

/亞類

重鏈

輕鏈

分子量(KDa

結構

功能

 

IgA1

α1

λκ

150-600

單體-四聚體

最常引發的免疫球蛋白主要產生于粘膜部位,如腸道、 呼吸道和泌尿生殖

 

 

α2

系統,阻止病菌在黏膜的定居,能抵 抗消化并可分泌至乳汁中。

 

IgA2

 

 

 

 

IgD

δ

λκ

150

單體

功能不詳;與 IgM 共同存在于 B 細胞發育的各個階段;大部分與 B 細胞結合。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IgE

ε

λκ

190

單體

結合變應原引發巨細胞釋放組胺,可引起變態反應, 也可以對抗寄生蟲感染。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IgG1

γ1

 

 

 

血清中最主要的免疫球蛋白。在免疫反應中提供 最主要的抗體以抵御病原

 

IgG2a

γ2

 

 

 

 

λκ

150

單體

菌的侵襲,溫和的補體 固定劑 (IgG3);可通過胎盤。

 

IgG2b

γ3

 

 

 

 

 

 

IgG3

γ4

 

 

 

 

 

IgG4

 

 

 

 

 

 

IgM

μ

λκ

900

五聚體

最早產生的反應性抗體,在 B 細胞表面表達,分泌型有 很高的親和力。在

 

B 細胞介導的免疫反應早期、產生足 夠的 IgG 之前發揮作用,消除病原菌。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

雞的 IgY

 

 

在生產多克隆抗體時,選擇雞會比兔和羊有更大優勢。

 

 

1. 雞不是哺乳動物,因此更易產生針對哺乳動物抗原的高親和性抗體(特別是高度保守的哺乳動物蛋白)。

 

 

2.  眾所周知,這是產生多克隆抗體的最合乎倫理的途徑,不需雞血,只要簡單收集雞蛋就可以。我們的母雞是以六只一組喂養,而我們有獨特的辨認雞蛋系統,使雞能自由走動。

 

 

3.  一只雞就可以產生大量抗體,每個月大約可達 3 IgY,是兔子的 10-20 倍,而且與兔子相比,雞產生抗體的周期更快,早在第 25 天就 可以從雞蛋中獲取高滴度的抗體。

 

4.  由于 IgY 存在于雞蛋中,而雞蛋可以收集起來并長期儲存,還可以根據不同批次抗體的滴毒和/或親和力來追溯性的從雞蛋中純化我們想要 IgY。

 

喂養和修建雞舍的費用低于兔子。  

 

  IgY 是一種很穩定的抗體,具有以下和哺乳動物 IgG 相同的特征:  

 

?  二價

 

?  可被木瓜蛋白酶降解成二價 Fab 片段

 

?  通過標準程序可以進行酶標記、生物素標記和金標記

 

 

7. IgY Fc 片段與哺乳動物的 IgG 有明顯的不同

 

?  不會結合哺乳動物的類風濕因子或其它自然產生的抗哺乳動物抗體的抗體(如 HAMA),從而降低實驗背景

 

?  不會激活哺乳動物的補體系統

 

?  不會結合哺乳動物的 Fc 受體

 

?  不會結合金葡菌蛋白 A 或蛋白 G

 
 
第二章:抗體形式及抗體純化  

 

對于血清、腹水和組織培養上清的澄清,離心和過濾是基本的實驗室技術。這些技術可以去除會阻塞層析柱的脂類和小顆粒物質。對于某些樣品,緩沖液置換和除鹽也是必要的步驟。硫酸銨沉淀作為更進一步的預處理步驟,經常用于濃縮腹水中的免疫球蛋白。

 

抗血清

 

多克隆抗體通常是未經純化的,稱為血清或抗血清??寡迨侵敢丫チ四鞍綴脫煜赴拿庖咚拗韉難???寡灝兄擲嗟目固?/span>/免疫球蛋白以及其它血清蛋白。它所包含的不僅有識別靶抗原的抗體,還有識別非靶抗原的抗體,在免疫分析中有時會發生非特異性反應。由于這個原因,粗制抗血清通常要進行純化,以去除血清蛋白,增加能特異和靶抗原相結合的免疫球蛋白的比例。

 

組織培養上清

 

單克隆抗體可以通過雜交瘤細胞培養(細胞分泌性抗體)并收獲雜交瘤組織培養上清來獲得。

 

腹水

 

單克隆抗體可以通過在小鼠(或大鼠)的腹腔中生長雜交瘤細胞而產生。雜交瘤細胞注射入小鼠以后,就會在小鼠腹腔繁殖并產生液體(腹水)。這種腹水就包含了高濃度的可收獲抗體,比雜交瘤細胞培養有更高的抗體產量。

 

抗體純化

 

多克隆抗血清或單克隆腹水/組織培養上清通常通過下述三種方法中的一種來進行純化:

 

  1. 蛋白A/G純化

     

    蛋白 A/G 純化是應用金黃色葡萄球菌的蛋白 A 或鏈球菌的蛋白 G 對免疫球蛋白 Fc 段的高親和性。蛋白 A/G 純化從粗制抗血清中去除了血清蛋白,但沒有去除非特異的免疫球蛋白組分。結果蛋白 A/G 純化的抗血清仍然具有一小部分不期待的交叉反應性。

     

    1. 親和純化

       

      親和純化就是通過相似性分離某一特定蛋白或具有相似特征的一組蛋白。這種分離蛋白的技術是基于在蛋白和耦合于層析介質上的特定配基之間的一種可逆的相互作用。 抗原親和純化的優勢是免疫球蛋白能夠特異性地同刺激它產生的抗原進行結合,結果消除了大量的非特異免疫球蛋白成分,將能特異與靶抗 原相結合的免疫球蛋白成分富集。因此親和純化后獲得的主要是含所期待的特異性免疫球蛋白。

       

  1. 預吸附

     

    多克隆抗體有時要經過預吸附。也就是說它們要被不同物種來源的其它蛋白或血清吸附,以消除可能的交叉反應的抗體。這樣純化后的抗體純度和特異性應很高,任何交叉反應都被顯著減少。

    第三章:抗體選擇和稀釋比度

     

    對于任何一種特定的靶抗原,都有不止一種有效抗體。為了縮小選擇范圍,實驗中通常要考慮以下幾個方面:

     

  1. 分析或者應用類型

     

  2. 樣品的性質

     

  3. 樣品的種類

     

  4. 抗體宿主的種類

     

  5. 抗體的標記和檢測

     

    用途

     

    抗體數據表所顯示的用途都是已經得到檢測證明可以發揮作用的。如果某項用途沒有列出,并不意味著抗體不合適,而是還沒有檢測是否有該項用途或不知道抗體如何發揮作用。如果已經檢測并證明無效也會在表中列出。

     

    樣品的性質

     

    樣品的性質會告訴您哪個抗體最合適,至少要考慮以下兩個方面:

     

  1. 要檢測的蛋白區域。刺激宿主動物產生抗體的具有免疫原性的物質種類繁多,包括全長的蛋白、蛋白片段、多肽、整個生物機體(例如細菌)或細胞。免疫原通常在數據表中會有顯示(盡管在很多例子中由于專利原因找不到關于免疫原的詳細描述)。如果要檢測的是一個蛋白片段或全長蛋白的異構體或特定區域,那就要求選擇的抗體是由該特異片段或區域或者包含該特異片段或區域的免疫原刺激產生的。如果要通過 FACS 去檢測活細胞表面蛋白,則要求選擇的抗體是由蛋白的細胞外區域刺激產生的。

     

  2. 樣品的處理工藝。有些抗體要求樣品先進行特殊處理。例如,許多抗體只識別降解或變性蛋白,可能因為這樣會暴露藏在二次或三次折疊后蛋白內部的抗原表位。另一方面,有些抗體僅識別自然折疊狀態蛋白上的表位。(Abcam 公司用于 western blotting 的抗體,樣品都需進行降解和變性處理,除非在數據表中特殊標明)。當搜尋用于免疫組化的抗體時,則應注意有些抗體只適合用于未固定冷凍組織。有時,抗原修復步驟則必不可少,這樣可以消除由福爾馬林固定所引起交聯,因為有些抗體不能結合福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的靶目標。在數據表的應用章節會明確指出上述限制。

     

    樣品種類

     

    盡管由于具有足夠多的同源氨基酸序列,抗體可以和其它物種的同一靶蛋白反應,但是我們選擇的抗體仍然應該是來源于同一物種的抗原刺激產生的。如果樣品不是來自于列表所示的物種之一,也不能說明該抗體不可以用來檢測這種樣品,而可能是來自該物種的樣品沒被檢測過,因此我們很難推薦它的適用性。根據序列相似性可以預測交叉反應性:值得驕傲的是 Abcam 在數據列表里有 ExPASy NCBI BLAST 的鏈接,可以比對不同物種來源氨基酸序列的同源性。

     

    選擇抗宿主的類別

     

    一般來說,當用標記二抗來檢測非標記一抗時,產生一抗的宿主動物的類別就非常重要。對于免疫組化,產生一抗的宿主應盡可能的和樣品的宿主種類不同,以避免二抗的免疫球蛋白與樣品中內在的免疫球蛋白發生潛在的交叉反應。例如,用于檢測鼠源蛋白的一抗就不應來源于鼠或大鼠,來源于兔則是比較適合的選擇,接下來用檢測分子(酶、熒光、生物素等)標記的抗兔 IgG 的二抗進行結合。如果有已標記的一抗則可以直接避免上述交叉反應發生。對于不含內源性免疫球蛋白樣品的檢測,宿主的種類選擇不用很嚴格。例如進行 western blotting 的細胞裂解液就被認為不包含 IgG。而組織溶解液和組織培養上清(包括血清)則被認為是含免疫球蛋白的。Western blotting IgG 會以 50 25kDa 的條帶出現在降解和變性樣品中,分別相當于 IgG 分子的重鏈和輕鏈。

     

    選擇二抗

     

    二抗應來源于抗一抗的物種。舉例來說,如果您的一抗來源于鼠,那么二抗就應該選擇抗鼠的。我們建議仔細核對二抗數據表以確定您要使用的二抗。

    Abcam提供有大量標記各種熒光物質和染色物質的二抗。

     

    檢查您所用的一抗數據表的底部,將會顯示一些合適的二抗。

     

    為了找到您自己的二抗,可以使用我們的導航框或通過主頁中心的鏈接來選擇產品類型,然后選擇您一抗的種類,這樣會顯示大量適用于一抗種類的二抗。

     

    雙重染色抗體的選擇

     

    對細胞培養液或組織上清液進行雙免疫染色要求非標記一抗來源于不同物種的動物,而二抗則特異性識別其中一種一抗。二抗如果與其他動物來源的免疫球蛋白有交叉吸附,則會在數據表中明確說明。

     

    熒光和染料標簽

     

    標簽結合在抗體上使抗體的結合可見。標簽的選擇依據以下幾個方面

     

  1. 檢測方法:熒光或有色沉淀。熒光標簽會在特定波長的光激發下發光。根據它們自己激發和發光性質不同,有一些熒光標簽是可用的。在結合了合適的底物時,酶標簽HRPAP可以形成有色沉淀。

  2. 有效的封固劑(只限免疫組化):AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色劑均溶于酒精,因此要求使用水溶性封固劑。以上提到的其他有機物要想得到較好的折射率,最好使用有機封固劑封固。

    熒光素標簽需要水溶性封固劑。膽藻素蛋白(藻青蛋白/藻紅蛋白)需要不加甘油的水溶性封固劑,否則會產生淬滅效應。

     

  3. 生物素標記的抗體對于信號的放大是很有效的,比如可應用于親和素-生物素-酶或熒光復合物(通常縮寫為ABC試劑)或者親和素或鏈霉親和素結合酶或熒光染料檢測法。

     

     

    未純化抗體的建議稀釋和濃縮

     

    未純化抗體在某一特定抗體濃度下會發生很顯著的變化。如果不清楚給定的未純化抗體樣品的濃度,就可以參考下面的特殊范圍作為估計的指導。

     

 

組織培養上清

腹水

全抗血清

純化的抗體

 

 

 

 

 

WB/斑點雜交

1/100

1/1000

1/500

1μg/ml

IHC/ICC

純度達到 1/10

1/100

1/50-1/100

5μg/ml

EIA/ELISA

1/1000

1/100000

1/500

0.1μg/ml

FACS/流式細胞術

1/100

1/1000

1/500

1μg/ml

IP

-

1/100

1/50-1/100

1-10 μg/ml

 

 

 

 

 

濃度估計

1-3 mg/ml

5-10 mg/ml

1-10 mg/ml

 


聲明:以上內容由Abcam公司提供。


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