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ELISA 實驗方案大全

時間:2017-12-14 16:37:42 瀏覽:


一、間接 ELISA




1、緩沖液和試劑

通常將未知濃度樣品與陽性對照標準曲線相比較,可精確定量。每塊板都要帶標準(做平行或者三份)和空白對照以保證精確性。

常規程序

包被抗原

- 用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀釋抗原到 PVC 微孔板上的第一排孔,按要求往后進行系列稀釋。

- 樣品純度較高時通常在酶標板上稀釋到不低于 2μg/ml。

- 不一定用純化的溶液,不過,一般在試驗樣品中目的蛋白(抗原)含量需大于 3%。

- 抗原的蛋白濃度在酶標板上應該不高于 20μg/ml,此時已經足夠中和酶標板上的位點了。

- 確??乖吶ǘ仍誑固蹇梢約觳獾降姆段?。

- 在酶標板上覆蓋封口膜,室溫孵育 2 小時,或者 4°C 過夜。包被的孵育時間需要優化。

- 倒掉孵育溶液,用 PBS 每孔 200μl 洗板 3 次。在水池上輕甩倒掉洗液,在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

封閉

- 用 200μl 含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標板上剩余的蛋白結合位點?;蛘哂悶淥獗占寥?BlockACE、BSA(牛血清 蛋白)代替。

- 用封口膜覆蓋酶標板室溫至少孵育 2 小時,或者 4°C 過夜。

- 用 PBS 洗板 2 次。

- 加一抗和二抗進行孵育

- 每孔加入 100μl 稀釋好的一抗。

- 用封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 2 小時,該孵育時間需要進行優化。盡管 2 小時的孵育通??梢曰竦米愎磺康男藕?,但如果獲得的信號較弱時 ,通過 4°C 孵育過夜通??梢曰竦媒锨啃藕?。

- 用 PBS 洗板 4 次。

- 加 100μl 標記二抗,稀釋到最佳濃度(參照說明書),使用前用封閉液現配。

- 用封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 1-2 小時。

- 用 PBS 洗板 4 次。

檢測

雖然許多種類的酶都可以用來檢測,但辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 實驗中是被廣泛應用的兩種酶。我們必須要考 慮到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性(例如肺泡細胞中高含量的 AP,紅血球中高含量的過氧化物酶),這可能導致不精確的結果。 如果有必要的話,用左旋咪唑(針對 AP)或含 0.3% 雙氧水溶液的甲醇(針對過氧化物酶)進行一個附加的封閉處理。

AP 底物

pNPP(對硝基苯基磷酸鹽)是最廣泛使用的底物。室溫下孵育 15-30 分鐘后,硝基酚的黃顏色可以在 405nm 下被檢測出(這一反應可以通 過加入適當量的 0.75M 氫氧化鈉溶液來終止)。

HRP   顯色劑

HRP    的底物是過氧化氫,反應中,過氧化氫分裂使氫供體氧化產生顏色變化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基對二氨基聯苯

加 TMB 溶液至每孔,孵育 15-30 分鐘,加相同分量終止液(2M 硫酸),在 450nm 下讀取吸光度值。

OPD (鄰苯二胺鹽酸鹽)

終產物在 492nm 下檢測。需要注意的是這種底物對光敏感,因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氫二銨鹽)

終產物是綠色的,在 416nm 測定吸光度值。

注意:一些酶底物是有害的(致癌物),因此必須小心操作并佩戴手套。

- 用多通道吸液器向每孔加入 100μl(或 50μl)底物。

- 顯示出足夠深的顏色之后,再向每孔加終止液 100μl(如果必須)。

- 用酶標儀讀每個孔的吸光度值(光密度)。

數據分析

根據連續稀釋的數據制作一條標準曲線,x軸為濃度(對數轉換),y軸為吸光度值(線性)。將樣品吸光度值代入標準曲線求出濃度。

 

二、直接ELISA操作步驟

1、常規程序

包被抗原

- 用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀釋抗原到 PVC 微孔板上,按要求往后進行系列稀釋。

- 樣品純度較高時通常在酶標板上稀釋到不少于 2μg/ml。

- 不一定用純化的溶液,不過,一般在試驗樣品中目的蛋白(抗原)含量需大于 3%。

- 抗原的蛋白濃度在酶標板上應該不高于 20μg/ml,此時已經足夠中和酶標板上的位點了。

- 確??乖吶ǘ仍誑固蹇梢約觳獾降姆段?。

- 在酶標板上覆蓋封口膜,室溫孵育 2 小時,或者 4°C 過夜。包被的孵育時間需要優化。

- 倒掉孵育溶液,用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上輕甩倒掉洗液,在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。封閉

- 用 200μl 含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的PBS緩沖液封閉酶標板上剩余的蛋白結合位點?;蛘哂悶淥獗占寥?BlockACE、BSA(牛血清蛋 白)代替。

- 用封口膜覆蓋酶標板室溫至少孵育 2 小時,或者 4°C 過夜。

- 用 PBS 洗板 2 次。

加抗體孵育

-加入 100 μl 抗體,稀釋到最佳濃度(參照說明書),使用前用封閉液現配。

- 用封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 2 小時,該孵育時間需要進行優化。盡管 2 小時的孵育通??梢曰竦米愎磺康男藕?,但如果獲得的信號較弱 時,通過 4°C 孵育過夜通??梢曰竦媒锨啃藕?。

- 用 PBS 洗板 4 次。

檢測

- 用多通道吸液器向每孔加入 100μl(或 50μl)底物。

- 顯示出足夠深的顏色之后,再向每孔加終止液 100μl(如果必須)。

- 用酶標儀讀每個孔的吸光度值(光密度)。

注意:一些酶作用物是有害的(致癌物),因此必須小心操作并佩戴手套。

數據分析

- 根據連續稀釋的數據制作一條標準曲線,x 軸為濃度(對數轉換),y 軸為吸光度值(線性)。將樣品吸光度值代入標準曲線求出濃度。

三、夾心 ELISA

夾心 ELISA 用兩種抗體協同測定抗原的含量(例如:捕獲抗體和檢測抗體)??乖匭氚遼?span> 2 個能被抗體識別的抗原位點才能被檢測 ,因為至少有 2 個抗體參與到這個試驗中。

 

夾心 ELISA 中,單克隆抗體和多克隆抗體都可以被用作捕獲和檢測抗體。單抗識別單一的抗原表位,可以區別抗原的微小差別使抗原得到 更精確地檢測和定量。多克隆抗體通常被用作捕獲抗體,以捕獲盡可能多的抗原。

夾心 ELISA 的優勢是樣品在分析前不需要純化, 檢測靈敏度高(靈敏度是直接法或間接法的 2-5 倍)。

注意事項:

夾心 ELISA 的步驟很難優化,試驗中應使用測試過的配對抗體。這樣可以確保在不干擾其他抗體結合的情況下,檢測目標蛋白上相應的不同 抗原表位。因此對于沒有做過特定測試試驗的抗體,我們不能確保我們的抗體可以用于夾心 ELISA。請參閱抗體說明書有關抗體測定應用的信息。

 

1、常規步驟:

包被捕獲抗體

- 用碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液 (pH7.4) 稀釋捕獲抗體至濃度 1-10μg/ml,包被酶標板。

  如果使用了沒有純化的抗體(例如:腹水或抗血清),可能需要通過提高樣品蛋白濃度(試一下 10μg/ml),來補償特定抗體數量較低的問題。

-  用封口膜覆蓋酶標板,于 4°C 孵育過夜

- 倒掉包被液,用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上輕甩倒掉洗液,在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

封閉和加樣品

- 封閉包被后孔內殘留的蛋白結合位點,每孔加 200μl,含 5% 脫脂奶粉的 PBS 封閉液。

- 用封口膜覆蓋酶標板,室溫孵育至少 1-2 小時或者如果方便的話,4°C 孵育過夜。

- 每孔加 100μl 適當稀釋的樣品。在精確定量測定時,通常將未知濃度樣品與陽性對照標準曲線相比較,每塊板都要帶標準(做平行或者三 份)和空白對照以保證精確性。37°C 孵育 90 分鐘。

- 對于定量檢測,標準品的使用濃度應覆蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。您可能需要優化標準品的濃度使用范圍,以確保得到一個合適的標準曲線。為了精確定量,樣品和標準通常做 2 份或 3 份。

- 倒掉樣品,每孔用 200μl PBS 洗板 2 次。

- 用檢測抗體和二抗先后進行孵育

- 每孔加入 100μl 稀釋好的檢測抗體。

  確保檢測抗體與包被抗體識別目標蛋白上不同的抗原表位,這防止了抗體結合的沖突,保證第二個抗體結合位點可以用來結合,盡可能的使用測試過相匹配的配對抗體。

- 用封口膜覆蓋酶標板,室溫孵育 2 小時。

- 用 PBS 洗板 4 次

- 加入 100μl 標記二抗,使用前用封閉液快速稀釋至最佳濃度(根據說明書)。 

- 用封口膜覆蓋酶標板,室溫孵育 1-2 小時。 

- 用 PBS 洗板 4 次。

檢測

雖然許多種類的酶都可以用來檢測,但辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 實驗中是被廣泛應用的兩種酶。我們必須要考慮 到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性(例如肺泡細胞中高含量的AP,紅血球中高含量的過氧化物酶),這可能導致不精確的結果。如 果有必要的話,用左旋咪唑(針對 AP)或含 0.3% 雙氧水溶液的甲醇(針對過氧化物酶)進行一個附加的封閉處理。

AP 底物

pNPP(對硝基苯基磷酸鹽)是最廣泛使用的底物。室溫下孵育 15-30 分鐘后,硝基酚的黃顏色可以在 405nm 下被檢測出(這一反應可以通 過加入適當量的 0.75M 氫氧化鈉溶液來終止)。

HRP    顯色劑

HRP 的底物是過氧化氫,反應中,過氧化氫分解使氫供體氧化產生顏色變化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基對二氨基聯苯)

加 TMB 溶液至每孔,孵育 15-30 分鐘,加適量終止液(2M 硫酸),在 450nm 下讀取吸光度值。

OPD (鄰苯二胺鹽酸鹽)

終產物在492nm下檢測。需要注意的是這種底物對光敏感,因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氫二銨鹽)

終產物是綠色的,在 416nm 測定吸光度值。


注意:一些酶作用物是有害的(致癌物),因此必須小心操作并佩戴手套。

         使用多通道移液器每孔加入底物溶液 100μl(或 50μl)。

 

數據分析 

- 根據連續稀釋的數據制作一條標準曲線,x 軸為濃度(對數轉換),y軸為吸光度值(線性)。將樣品吸光度值代入標準曲線求出濃度。

 

四、ELISA 疑難解答提示

1、陰性對照出現陽性結果

- 試劑/樣品污染

   試劑和樣品可能被污染,或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑,小心操作移液器。

- 夾心ELISA  - 檢測抗體與包被抗體反應

   確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體,他們之間不會互相反應。

- 酶標板洗板不徹底

  用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌,洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈。

- 抗體量過多導致非特異結合

根據推薦用量使用抗體。盡量使用較少的抗體。

2、酶標板整體背景高

- 結合反應太強或時間過長

  檢查底物的稀釋,使用建議的稀釋度。當酶標板顯色足夠進行吸光度讀取時立即用終止液終止反應。

- 底物溶液或終止液不是新配制

  使用新配制的底物溶液。終止液應該是清亮的(如果它變黃,這是被污染的標志,需要重新配制)。

- 沒有終止反應

  如果底物反應沒有被終止,顏色會繼續變化。

- 酶標板在酶標儀讀板前放置時間過長

顏色會繼續變化(盡管加了終止液,依然會以很慢的速度變化)。

- 試驗器皿污染 

  確保試劑是新配的并且使用的是清潔的玻璃器具

- 底物孵育過程沒有避光

  底物孵育應該在避光條件下進行。

- 孵育溫度過高

  抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性。確保孵育在正確的溫度下進行,孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優化。

- 抗體非特異性結合

  確保進行了封閉并使用的是恰當的封閉液。我們建議使用 5-10% 的與二抗同種動物來源的血清或牛血清。

  確保板孔經過預處理以防止非特異結合。使用親和力強、純度高的抗體,最好經過了預吸收。

3、吸光度數值低

- 使用的樣品中沒有顯示出靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低

  檢查靶蛋白表達系統,確保它在您的樣品中被表達出來。如果靶蛋白的表達水平低,需要增加樣品使用量,或者您可能需要選擇一個更靈敏 的測定方法。確保您使用的是沒有超出測定方法檢測范圍的陽性對照。

- 抗體不足

  確定使用的是建議的抗體量,為了使結果更好可能需要增加抗體的濃度。

- 底物溶液不是新鮮配制或成分有誤

  使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內并且被正確儲存,使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

- 試劑不是新鮮配制或pH值有誤

  確保試劑配制正確并在有效期內。

- 孵育時間不夠長

  如果建議了孵育時間,確保按推薦的時間長度孵育抗體。為了使結果更理想,孵育時間可能需要增加。

- 孵育溫度太低

  抗體在適宜的溫度下有最佳的結合活性,確保孵育是在正確的溫度下進行,孵育箱要設定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優化。確保所有的試劑在使用前是室溫。

- 未加終止液

  加入終止液可以增加顯色反應的強度,也能固定反應最終的顏色。

 

4、吸光度數值高

樣品和/或陽性對照吸光度數值高。吸光度沒有按樣品在板子上的稀釋度遞減。

   樣品或陽性對照的濃度過高,超出了試驗方法檢測的范圍。重新設置試驗方法或者在加樣前通過稀釋降低樣品和對照的濃度,在處理結果計 算濃度時考慮到所作的稀釋。

5、酶標板上吸光度不規律

孵育時酶標板疊在一起

  酶標板疊在一起使板子每個孔的溫度不能平衡一致,請避免堆疊。

- 吸液不一致

  確保移液器使用正確并經過校準、確保槍頭插得足夠緊密。板子稀釋時要特別仔細,注意確保每個槍頭都吸上和排出正確量的液體,這對平 行樣品結果的一致性有很大影響。

- 抗體稀釋液/試劑未混勻

  為保證板子所有孔的濃度一致,確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被混合均勻。

- 板孔變干涸

   確保所有孵育期間酶標板始終被蓋好。放置一個潮濕的水盤(保持清潔,無菌水)在孵育箱的底部。

- 洗板不充分

   這將導致一些孔沒有其他孔清洗的好,殘留不同量的未結合的抗體,使后面的結果產生不一致。

- 酶標板底部不凈影響吸光度讀取

  讀板前小心清潔酶標板底部。

 

5、顏色變化過慢

酶標板未處于恰當的溫度中

  確保酶標板處于室溫,試劑在使用前也處于室溫。

- 結合能力太弱

  使用前新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內并且被正確儲存,使用的濃度也是正確的。確保試劑按正確的濃度使用。

- 溶液污染 

  例如象疊氮化鈉和過氧化物酶這類污染物的存在,將會影響底物的反應,避免使用含有這些防腐劑的試劑。


 

 聲明:以上內容由Abcam公司提供。

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