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免疫沉淀實驗方案大全

時間:2017-12-14 18:13:54 瀏覽:

免疫沉淀(IP

一、免疫沉淀步驟

免疫沉淀是一種純化蛋白質的方法。將我們感興趣的一種蛋白質的抗體與細胞提取液孵育,以使抗體和蛋白質在溶液中結合。然后用蛋白A/G 耦合的瓊脂糖凝膠,從樣品中將抗體/抗原復合物提取出來。這種物理方法可將所需蛋白質從樣品中分離出來。然后樣品可以通過SDS-PAGE 分離出來進行Western blot 分析。

1、 裂解緩沖液

理想的裂解液將保留蛋白質的天然構象,將抗體結合位點變性減到最少,同時從樣本中釋放足夠量的蛋白質,以滿足接下來的分析。非離子型去污劑比如NP - 40 和Triton X-100 比離子型去污劑如SDS 和脫氧膽酸鈉要溫和一些。其它可以影響到IP 成功的因素包括鹽濃度、二價陽離子濃度和pH 值。

- 0-1 M

- 0.1-2% 去污劑,非離子型

- 0.01-0.5% 去污劑,離子型

- 0-10 mM 二價陽離子

- 0-5 mM EDTA

-pH 值:6-9

變性裂解液

用于去污劑可溶性抗原,并且抗體可識別其天然構象。

- RIPA(放射免疫沉淀法)緩沖液

比裂解液NP - 40 或Triton X -100 更能使蛋白質變性,RIPA 緩沖液含有離子型去污劑SDS 和脫氧膽酸鈉作為活性成分,對裂解核膜進行核內提取特別有用。RIPA 緩沖液可以降低背景,但同時可使某些蛋白變性,包括蛋白激酶。

- 不含去污劑的可溶性蛋白裂解液

使用含EDTA 和疊氮鈉的PBS。有些可溶性蛋白不需要使用去污劑。對細胞使用此緩沖液并加上機械破損,例如反復通過注射器或用Dounce 勻漿器勻漿。

- 變性裂解液或用于不溶性抗原緩沖液的去污劑

天然蛋白質的抗原表位總是不容易靠近只識別變性蛋白質的抗體。當收集和裂解細胞時,用變性裂解液加熱細胞。這個方法也可用于非離子型去污劑不能從細胞中提取的抗原。用DNase1 將有助于從染色質中提取蛋白質。

其他試劑:

蛋白酶抑制劑

一旦裂解發生,水解、去磷酸化和變性就開始了。如果樣本在冰上或始終在4°C 存放以及一開始就往裂解液中加入適當抑制劑的話,這些反應將可以大大減緩?;旌希ā凹ξ簿啤保┑牡鞍酌負土姿崦敢種萍烈丫唐坊?。如果不使用混合的蛋白酶抑制劑,IP 實驗中最常用的兩種蛋白酶抑制劑是PMSF(50μg/ml)和抑肽酶(1μg/ml)。磷酸酶和蛋白酶抑制劑的詳細資料,請參閱我們的蛋白質免疫印跡實驗指南。所需的其他試劑:

- 無菌PBS pH 值7.4

- 無菌PBS-牛血清白蛋白1% W/ V(過濾)

-TBST 緩沖液

- 蛋白免疫印跡實驗的加樣/樣品緩沖液

 -100 mM EDTA 貯備液:1.86g EDTA 溶解到40ml 水中。加氫氧化鈉調整pH 至7.4。最后定容到50ml。

2 、裂解物制備

培養細胞的裂解

非變性:

- 將細胞培養皿放置冰上并用冰冷的PBS洗滌細胞。

- 吸干PBS 后,再加入冰冷的裂解液(每107 細胞/ 100mm2 培養皿/150cm2 培養瓶加1ml,每5x106 細胞/ 60mm2 培養皿/ 75cm2培養瓶加0.5ml)。

- 用預冷的塑料細胞刮刀將貼壁細胞從培養皿上刮下,然后輕輕將細胞懸液轉移到預冷的EP 管中。

- 4°C 持續振蕩30 分鐘。

- 放入微型離心機4°C 離心。

- 從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。將上清液吸出轉移到預冷的新管(放在冰上)中,棄沉淀。


變性:

- 加100μl 變性裂解液至0.5-2 × 107 個細胞中。

- 用渦旋混合器最大速度劇烈震蕩2-3 秒。將細胞懸液轉入EP 管。

- 由于DNA 的釋放,這步的溶液是粘性的。

- 樣品加熱95°C 5 分鐘變性。

- 用0.9 ml 非變性裂解液稀釋懸液,輕輕混合。(非變性裂解液中過量1% Triton X – 100 可以淬滅原來變性緩沖液中的SDS)。

- 將裂解的懸液通過1ml 注射器針頭5-10 次,把DNA 打成片段。

-  冰上孵育5 分鐘。

- 進行免疫沉淀反應。

組織裂解

用干凈器械解剖所要的組織,最好在冰上,并快速操作以防止蛋白酶降解。

- 將組織放入圓底離心管中,浸入液氮中速凍。樣本在-80°C 儲存備以后使用或放在冰上立即勻漿。

- 對于約5mg 組織,向管中迅速加入約300μl 裂解液并用電動勻漿器均漿。

- 裂解液沖洗刀片兩次,每次300μl,然后4°C 持續振蕩2 小時(將回旋振蕩器放入冰箱)。

裂解液的體積根據組織總量來決定。蛋白提取物不宜過于稀釋,以避免蛋白質損失,并盡量減少樣品體積以便凝膠上樣。最小濃度為0.1mg/ml;最佳濃度為1-5mg/ml。

- 微型離心機4°C 12000rpm 離心20 分鐘。從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。吸出上清液放入預冷的新管(放在冰上)中,棄沉淀。

3、裂解物的預清除程序

裂解物預清除可以幫助減少蛋白質非特異性結合到agarose (瓊脂糖)或Sepharose beads (凝膠瓊脂糖珠)。用無關抗體或血清預清除,可去除蛋白質與免疫球蛋白的非特異結合。最終實驗結果背景降低并且信噪比提高。但是,如果最后蛋白質是由免疫印跡實驗檢測,預清除未必必要,除非是污染蛋白質對目的蛋白質產生明顯干擾。

- 加入50μl 同種動物來源和型的無關抗體或正常血清作為免疫沉淀抗體(一些研究人員首選兔,參考Harlow and Lane,243 頁)到1ml 裂解物中,在冰上孵育1 小時。

- 加入100μl 珠漿。

- 4°C 孵育10-30 分鐘并輕輕攪拌。

- 微型離心機14000g 4°C 離心10 分鐘。

- 丟棄珠子并保留上清進行免疫沉淀。為了提高收率,珠子可用裂解液洗滌1 或2 次以上,并將上清收集在一起。

4、免疫沉淀

- 在冰上預冷離心管中加入10-50μg 含推薦量抗體的細胞裂解物。具體數量將根據蛋白質的豐度和抗體與蛋白質的親和力來選擇。通常在預實驗中,通過增加抗體的量沉淀固定數量的蛋白質。

您可以查看抗體數據表獲得建議抗體的濃度。以下供參考使用:

1-5μl 多克隆抗體血清

1μg 親和純化的多克隆抗體

0.2-1μl 腹水(單克隆抗體)

20-100μl 培養液上清(單克隆抗體)

- 樣品和抗體孵育的固定時間4°C 1-12 小時(過夜),最好輕輕振蕩或旋轉。孵育時間的長短取決于蛋白質的量和抗體的親和特性。如果買來的珠子是粉末,100mg 的珠子與1ml 0.1M PBS 孵育,洗1 小時后珠子膨脹起來,然后離心,去除上清。加入1ml 含0.1% BSA (牛血清白蛋白) PBS,混合1 小時,PBS 洗滌2 次。去除上清并加入400μl 含蛋白酶抑制劑的緩沖液(可與裂解液相同)就可以使用了。它可以在4°C 儲存幾天;在含0.02% 疊氮鈉的PBS 里會保存更長時間(使用當天用新鮮裂解液充分洗滌珠子)。您也可以購買事先膨脹好的珠子直接使用。

- 漿料混合好,向每個樣本中加入70-100μl。始終保持樣品在冰上。珠子將傾向于粘著吸頭,所以盡量減少珠子在吸管中運動并使用從尖端切斷5mm 的吸頭。

- 裂解珠子混合液4°C 孵育4 小時并旋轉振蕩(最佳孵育時間可由預實驗確定)。

- 當孵育結束后,管子離心,去除上清液并用細胞裂解液洗滌珠子3 次(每次4°C 離心去除上清)。

- 最后,去除最后一次上清并加入25-50μl 2×上樣緩沖液。95-100°C 煮沸5 分鐘,以變性蛋白質并將其與蛋白- A /G 珠子分離,隨后離心并保持上清含有蛋白質。然后,您可以凍存樣品或進行SDS – PAGE 電泳。

5、 選擇合適的微珠,匯總表

各種來源免疫球蛋白類型

蛋白A

蛋白G

IgG1

+++

+++

 

 

 

IgG2

+++

+++

 

 

 

IgG3

-

+++

 

 

 

IgG4

+++

+++

 

 

 

IgM

用抗人IgM

 

 

 

 

IgE

-

+

 

 

 

IgA

-

+

 

 

 

小鼠IgG1

+

+++

小鼠IgG2a

+++

+++

小鼠IgG2b

++

++

小鼠IgG3

+

+

小鼠IgM

用抗小鼠IgM

 

 

 

 

大鼠IgG

-

+

 

 

 

大鼠IgG2a

-

+++

大鼠IgG2b

-

++

大鼠IgG2c

+

++

雞全部亞型

-

++

 

 

 

奶牛全部亞型

++

+++

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + = Weak binding, - = No binding

 

 

 

 

6、使抗體與微珠交聯的步驟:

降低洗脫蛋白質溶液中污染的抗體數量:

為了使洗脫蛋白較少污染抗體,也為了更純凈蛋白質的制備和干凈的免疫印跡實驗,推薦將抗體與珠子交聯。下面是一個實驗程序舉例(幾個網站有關于這個程序有很多信息)。目標蛋白應該用溫和的洗脫液洗脫,如甘氨酸緩沖液。

試劑:

交聯試劑:鄰苯二甲酸二甲酯(DMP儲液濃度13mg/ml

洗脫試劑:1M 甘氨酸(加濃鹽酸調整pH 值至3

稀釋緩沖液:PBS+ 1mg BSA 1ml PBS

洗滌緩沖液:0.2M 三乙醇胺的PBS(每100ml 緩沖液中含3.04ml 三乙醇胺)

淬滅緩沖液:50mM 乙醇胺的PBS311.7μl/100ml

準備工作:

- 珠子用PBS 2 次。最終濃度為50 珠漿。

- PBS 混合均勻并4°C 旋轉過夜。

交聯:

- 微量離心機(14000rpm 1分鐘)離心沉淀以洗滌珠顆粒。吸出PBS 上清液。

- 1:1 比例加入稀釋緩沖液,輕輕混合并4°C 旋轉10 分鐘。微型離心機離心并如上吸出/摒棄上清。

- 按需要的濃度用抗體稀釋緩沖液準備抗體溶液(參見抗體說明書的建議濃度)。1:1 比例將抗體加入,輕輕混合并4°C 旋轉1 小時。

- 離心并吸出/摒棄上清。

- 1:1 的比例將稀釋緩沖液加入,4°C 旋轉5 分鐘。離心并吸出/摒棄上清液。

- 1:1 的比例將PBS 加入,離心并吸出/摒棄上清液。

- 1ml 洗滌緩沖液,溶解1ml 準備好的13mg/ml DMP 儲液。迅速漩渦震蕩混合。1:1 的比例將DMP 溶液加入,室溫(RT)旋轉30分鐘。

- 用洗滌緩沖液洗滌珠子(室溫旋轉5 分鐘,離心并吸出/摒棄上清液)。

- 1:1 比例第二次加入DMP,室溫旋轉30 分鐘,按之前方法洗滌。

- 1:1 比例第三次加入DMP,室溫旋轉30 分鐘,按之前方法洗滌。

- 淬滅和洗滌。

- 1:1比例加入淬滅緩沖液,室溫旋轉5 分鐘,離心并吸出/摒棄上清液;重復該步驟。

- PBS 洗。

- 去除多余的(未交聯)抗體:

- 1M 甘氨酸(pH3)洗滌。室溫旋轉10 分鐘,離心并吸出/摒棄上清液;重復該步驟。

- 存儲洗滌。

- 用免疫沉淀緩沖液洗滌(通常是PBS+吐溫)。室溫旋轉5 分鐘。

- 洗三次,最后一次旋轉后保存。珠子可以在4°C 儲存幾天??梢約尤?/span>0.02 - 0.05 疊氮鈉W/V 防止細菌生長。

免疫沉淀:


結合抗體的珠子現在可以進行如上常規IP 實驗流程。

為了防止抗體與目標蛋白質一起洗脫,用溫和的甘氨酸梯度洗脫(可到1M)。

7、IgM 抗體進行免疫沉淀

由于IgM 抗體的五聚體結構,所以很難用于免疫沉淀實驗。IgM 抗體還不能很好地結合蛋白A 或蛋白G。有兩種方法可供選擇:

蛋白L 珠子

蛋白L是一個36 kDa 的免疫球蛋白結合蛋白,可從大消化鏈球菌純化。蛋白L 可以結合抗體的輕鏈(而蛋白A G 結合抗體重鏈的Fc 段)。

蛋白L 比蛋白A G 結合抗體類型范圍更廣泛,因為重鏈的任何一部分都不參與結合相互作用。它能夠結合所有抗體類型,包括IgG、IgM、IgA、IgE IgD。單鏈可變區段(ScFv)和Fab 片段也能結合蛋白L。

蛋白L 僅限于結合那些含有kappa(κ) 輕鏈(即VL 功能區)的免疫球蛋白。在人類和小鼠中,以kappa (κ) 輕鏈為主。其余的免疫球蛋白有lambda(λ) 輕鏈,它不結合蛋白L。此外,蛋白L 僅能有效結合kappa 輕鏈的某些亞型。例如,它結合人類VκI、VκIII VκIV 亞型,但不結合VκII 亞型。對于小鼠,僅限于結合那些具有VκI 輕鏈的免疫球蛋白。

利用蛋白L 有幾個優勢:

- 蛋白L 不能結合牛、綿羊或山羊的抗體,因此非常適合從含牛血清的細胞培養液中純化小鼠IgM。

- 蛋白L 可以結合多種動物來源抗體的kappa 輕鏈而不干擾抗原結合位點,因此非常適用于用IgM 抗體的免疫沉淀。

- 它能結合所有類別的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE IgD),因此對IgM 純化特別有用,因為IgM 不能用蛋白A G 純化。

使用結合了抗IgM IgG 的蛋白A G 珠子

此方法涉及抗IgM 抗體的IgG 耦聯蛋白A G 珠子(方法見下文)。這些珠子就可以在常規免疫共沉淀程序中使用IgM 抗體。通過結合抗-IgM 抗體,IgM 可以間接結合珠子。

下面的過程介紹了用DMP 如何把抗IgM 抗體與蛋白A G 涂層的珠子耦合:

試劑:

- 200mM 硼酸鹽緩沖液+ 3M 氯化鈉pH 9.0

- 20mMDMP)的200mM 硼酸緩沖液+ 3M 氯化鈉,pH 9.0

- 200mM 乙醇胺pH 8.0(乙醇胺儲液1:80 稀釋)

- 磷酸鹽緩沖液(PBS

- 蛋白A G 結合物)。

方法:

- 使用前1 小時將250mg 蛋白A G Sepharose(珠子)加入2ml PBS+0.1 疊氮鈉。這使得珠子膨脹。

- 將珠子與適當濃度的抗體室溫混合2 小時(旋轉或滾動)。

- 2500rpm 離心5 分鐘。

- 10 倍體積200mM 硼酸緩沖液+ 3M 氯化鈉洗珠子兩次。

- 20mM DMP 重懸珠子。

- 室溫旋轉/振蕩珠子30 分鐘。

- 將珠子2500rpm 離心5 分鐘。

- 200mM 硼酸鹽緩沖液+ 3M 氯化鈉洗珠子2 次。

- 20mM 乙醇胺洗珠子1 次。這步終止耦合反應。

- 20mM 乙醇胺重懸珠子并室溫旋轉2 小時。

- 將珠子2500rpm 離心5 分鐘。

- PBS 洗珠子2 次。

- 200mM 甘氨酸洗珠子2 次。

- PBS 洗珠子2 次。

- 珠子可以4°C 儲存在PBS + 0.1 疊氮鈉溶液里(PBS︰珠=1:1)。

8、免疫沉淀疑難解答提示

高背景

去污劑不溶性蛋白有殘留

- 離心后立即去除上清。沉淀中留有不溶性蛋白質,如果再次有懸浮發生,再次離心。

洗滌不充分

- 蓋上管蓋離心前反復顛倒幾次。

非特異性蛋白質與珠子結合。


 

- 珠子用BSA 預封閉不充分。確保牛血清白蛋白(組分V)新鮮,新鮮珠子與含1 牛血清白蛋白的PBS 孵育1 小時,使用前PBS 3-4 次。

使用的抗體特異性不夠。

- 使用親和純化的抗體,最好預先吸收。

使用太多抗體導致非特異性結合

- 減少細胞數量/裂解液使用。我們推薦使用10-500μg 細胞裂解液。

蛋白與抗體非特異性結合

- 如果有很多非特異結合的蛋白質,可以嘗試減少上樣珠子的樣本數量。您還可以在開始免疫沉淀實驗之前預先孵育珠子和準備好的裂解液(請參閱實驗方案)來預清除裂解液。這應該清除裂解液內任何與珠子非特異結合的蛋白質。一些研究人員也使用同種來源和相同免疫球蛋白亞類的無關抗體來預清除裂解液。

免疫沉淀實驗時抗原降解

- 確保樣品裂解時加入新鮮的蛋白酶抑制劑。

大量抗體被洗脫

太多抗體與目標蛋白質洗脫

- 嘗試減少抗體用量。免疫沉淀前將抗體與珠子交聯,并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫將大大減少抗體洗脫量。

沒有檢測到目的蛋白洗脫

所用樣品中不表達或低水平表達目標蛋白質

- 檢查目標蛋白質的表達譜,以確保它會在您樣品的細胞表達。如果有目標蛋白低水平表達,增加裂解液的使用量。但是,這可能導致增加非特異性結合,所以開始免疫沉淀程序之前最好預先清除裂解液。

沒有足夠的抗體捕獲目標蛋白

- 檢查抗體的建議使用量??固迮ǘ瓤贍芐枰黽?。

目標蛋白沒有從珠子上洗脫

- 確保您使用的洗脫緩沖液是正確的,并且是洗脫蛋白質所需的正確強度和pH值。

抗體沒有結合免疫吸附磁珠

- 確保您使用的珠子與抗體亞型匹配。

 


 

聲明:以上內容由Abcam公司提供。


 


 





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